Tecniche e problemi relativi al mantenimento a lungo termine di un ceppo fungineo.



Alcuni ceppi di funghi sono stati mantenuti dall'uomo per oltre un secolo, grazie a varie tecniche di conservazione e propagazione, altri invece sono andati persi a causa di vari problemi. Il corretto mantenimento di uno strain (ceppo) è abbastanza complesso, ma è la miglior garanzia contro una serie di problemi.
Quali sono questi problemi?


Contaminazione

Se durante la produzione, si verifica un problema di contaminazione, questa si propaga a tutti i discendenti di una linea rendendola inutilizzabile. Ciò non accade spesso, poiché questi problemi si manifestano solitamente nelle prime fasi della moltiplicazione del micelio e possono essere confinati a quel punto senza perdere l'intera produzione.
Le contaminazioni possono essere di varia natura e gravità, ad esempio da parte di semplici muffe competitrici, lieviti competitori, oppure muffe parassite come quelle del genere Trichoderma (si nutrono di altri funghi); batteriche (spesso facilmente trattabili con antibiotici), infine temibili infezioni virali che possono colpire il micelio e portarlo rapidamente alla degenerazione.
Vanno quindi sempre adottate le più scrupolose norme igeniche e pratiche di sterilizzazione (autoclave, lampade UV-C, filtrazione HEPA, ecc...).


Degenerazione genetica

La degenerazione dello strain è probabilmente il peggior incubo di un produttore di spawn: a causa della costante riutilizzo dello stesso ceppo, con il passare del tempo iniziano ad accumularsi piccoli difetti nel DNA.
Per un lungo periodo di tempo il ceppo può rimanere apparentemente stabile, per poi verificarsi un'improvvisa degenerazione e causare problemi come deformazioni degli sporofori, irregolarità o mancata fruttificazione, depigmentazione, perdita di vigore, ecc...
Questo è il motivo per cui il metodo di subcoltura può essere utilizzato solo per un periodo di tempo limitato. Dopo un po' il ceppo clonato deve essere abbandonato e sostituito con il ceppo originale conservato ad esempio per surgelazione o con la metodica Castellani. Dalla coltura madre si preleva un campione ed il processo di subcoltura può ricominciare.



Tecniche di conservazione :



Metodo di subcoltura

Il metodo di subcoltura è utilizzato da tutti i produttori di spawn professionali. È il sistema usato per la moltiplicazione delle colture madri attraverso i mezzi di duplicazione (es. piastre Petri, colture liquide), spesso creando discendenti paralleli delle stesse colture madri che vengono poi chiamate "linee". Queste linee vengono poi ulteriormente moltiplicate in spawn, repliche di spawn ed infine substrato di coltivazione.
È in effetti una forma di clonazione dell' essere vivente fungineo.
Spesso al fine di conservare dei campioni di micelio si ricorre alla preparazione di piastre Petri o provette con terreno di coltura agarizzato. Una volta verificata la corretta proliferazione del micelio si sigillano le colture e vengono poste in refrigerazione ad 1-2°C. La refrigerazione a queste temperature permette di rallentare il tasso di divisioni cellulari e mantenere il micelio in uno stato di "torpore" per molti mesi.
La ricerca scientifica e l'esperienza hanno dimostrato che è saggio duplicare il micelio ogni due anni al fine di prevenire degenerazioni. Un sistema semplice consiste nel prelevare in condizioni sterili una piccola parte di sporoforo e ricavare da questa delle colture di micelio in piastre Petri. Queste colture ottenute da sporoforo costituiranno quindi il ceppo genitoriale da cui deriveranno le nuove culture madri.


Congelamento

Il micelio può essere tenuto in condizioni di congelamento intenso per lunghi periodi di tempo se raffreddato a temperature estremamente basse. Non è noto con precisione per quanto tempo il micelio può sopravvivere in tali condizioni di congelamento, ma ci sono stati esperimenti per periodi della durata di 15 anni che producevano micelio ancora attivo, anche dopo cicli di scongelamento e ricongelamento.

Il congelamento richiede dai -80 ° C con sistemi di refrigerazione elettrici*, fino ai -196°C dell'Azoto liquido con sistemi criogenici*. I produttori che non usano questo od altri metodi di conservazione devono ricomprare i loro ceppi originali periodicamente per evitare la degenerazione.

* "Long-term cryopreservation of basidiomycetes"
Giani Andrea Linde, Alana Luciani, Ana Daniela Lopes, Juliana Silveira do Valle, Nelson Barros Colauto

* "Cryopreservation at −75 °C of Agaricus subrufescens on wheat grains with sucrose"
Lienine Luiz ZaghiJúnior, Ana Daniela Lopes, Fábio Aparecido Cordeiro, Itarua Machri Colla, Míria Benetati Delgado Bertéli, Juliana Silveira do Valle, Giani Andrea Linde, Nelson Barros Colauto



Metodo Castellani

Sviluppata dal professor Castellani*, questa metodologia consiste nella conservazione di frammenti di micelio immersi in acqua distillata sterile.
La conservazione in acqua offre numerosi vantaggi rispetto ad altre tecniche: la vitalità della coltura o il tasso di crescita non sono influenzati in modo significativo; gli isolati possono essere conservati più a lungo; la stabilità genetica è maggiore; il metodo è veloce, poco costoso e richiede meno spazio ed apparecchiature.

* "Preservation of fungi in water (Castellani): 20 years Mycopathologia, 1989, Volume 106, Number 2, Page 73" Claudia Hartung Capriles, Sofia Mata, Marianne Middelveen

* "Preserving cultures of wood-decaying Basidiomycotina using sterile distilled water in cryovials"
Harold H. Burdsall Jr. & Elizabeth B. Dorworth









- Ricette per Agar e terreni di coltura -


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